cDNA ist eine DNA, die mittels des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) aus RNA synthetisiert wird. Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase kann aus RNA die dazu komplementäre cDNA hergestellt werden. Diese spezifische, RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigt wie andere Polymerasen einen Primer (ein kurzer, komplementärer DNA-Abschnitt) zur Synthese, welcher an die RNA bindet. Das Produkt ist nun ein cDNA-Strang, der mit dem ursprünglichen RNA-Strang hybridisiert ist. Letzterer kann nun mit dem Enzym RNase H abgebaut werden. In der weiteren Prozessierung wird nun mittels einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase (über einen Primer) der komplementäre DNA-Strang zum schon bestehenden cDNA-Einzelstrang synthetisiert. Das Ergebnis ist eine doppelsträngige cDNA. Da die ursprüngliche Matrize eine prozessierte RNA war (die u. a. das Splicing schon durchlaufen hat), finden sich auf der cDNA im Gegensatz zu natürlichen eukaryotischen DNAs keine Introns.